Метод определения ферментов

МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТОВ

И.ЗОРОВ, канд. хим. наук, А.СИНИЦЫН, д-р хим. наук, проф., МГУ им. М.В.Ломоносова,

Т.ОКОЛЕЛОВА, д-р биолог. наук, ВНИТИП,

С.РУМЯНЦЕВ, канд. биолог. наук, А.МОРОЗОВ, канд. техн. наук, ООО Промфернент.

Применение в кормах ферментных препаратов позволяет повысить их усвояемость и питательность, улучшить реологические свойства, а при правильном применении уменьшить себестоимость конечной продукции.

В настоящее время многие производители предлагают готовые комбикорма с ферментными добавками, большинство из которых составляют ферменты, разрушающие некрахмальные полисахариды клеточной стенки зерна - целлюлазы, гемицеллюлазы, амилазы. Перед лабораторией птицефабрики, проводящей входной контроль качества комбикорма встает задача определения количества добавленного в него ферментного препарата. Во многих хозяйствах предпочитают использовать корма собственного приготовления, и в этом случае для получения корма с постоянно высокими пищевыми характеристиками контроль имеет приоритетное значение.

Существующие методы определения активности ферментов основаны на измерении концентрации восстанавливающих сахаров (ВС), образующихся при ферментативной обработке зерна. Однако значительная концентрация собственных сахаров зерна не позволяёт определять добавки низких концентраций ферментных препаратов из-за высокого фона холостого опыта и, как следствие, высокой ошибки.

Предлагаемый нами метод измерения активности по окрашенным субстратам дает возможность определять небольшие количества ферментных препаратов в кормах, а также, при необходимости, определять активность собственных ферментов зерна.

Помимо этого возможно определение специфических ферментативных активностей - общей целлюлазной, ксиланазной и других, что важно для подбора оптимального рациона при использовании разнородных зерновых компонентов корма.

Суть метода заключается в измерении интенсивности образования окраски при гидролизе синтетических окрашенных полисахаридных субстратов (окрашенной целлюлозы или окрашенного ксилана) под действием собственных или специально добавленных ферментов - целлюлаз или ксиланаз.

Необходимые для анализа приборы и материалы: автоматические пипетки 0,1-1 мл с наконечниками; пластиковые пробирки типа Эппендорф объемом 1,5 мл; термостат для пластиковых пробирок; микроцентрифуга; спектрофотометр видимой области; спектрофотометрические кюветы уменьшенного объема с оптическим путем длиной 1 см; секундомер; рН-метр.

Реагенты: карбоксиметилцеллюлоза, окрашенная активным оранжевым ЖТ (АОЖТ-КМЦ); ксилан, окрашенный активным оранжевым ЖТ (АОЖТ-ксилан); раствор ацетата натрия 0,1 М; уксусная кислота 0,1 М; ацетат цинка; этанол.

В работе использованы комбикорма на основе ячменя, ржи и пшеницы без добавления ферментов и с ферментными препаратами целловиридин Г20Х и Ровабио. Состав этих кормов приведен в таблице 1.

Смесь, состоящая из 60 % пшеницы и 40 % ячменя, была использована в качестве модельного корма для построения калибровок. В качестве субстратов использованы карбоксиметилцеллюлоза (АОЖТ-КМЦ) и арабиноксилан (АОЖТ-ксилан), окрашенные активным оранжевым ЖТ. Ферментный препарат целловиридин Г20Х применяли для построения калибровки.

1. Состав комбикормов, % (данные производителя)

1 группа	Пшенично-ячменный рацион без добавок
4 группа	Пшенично-кукурузный рацион с 5 % ржи
5 группа	ОР с 20 % ржи + 50 г/т Ровабио
7 группа	ОР с 30 % ржи + 60 г/т Ровабио
8 группа	ОР с 20 % ржи + 70 г/т целловиридина
10 группа	ОР с 30 % ржи + 100 г/т целловиридина

Методика анализа. Ацетатный буфер. 11,5 мл ледяной уксусной кислоты растворяют в 1500 мл дистиллированной воды, перемешивают и доводят объем до 2000 мл; 16,4 г безводного ацетата натрия растворяют в 1500 мл дистиллированной воды, перемешивают и доводят объем до 2000мл; буферный раствор (рН 5,0) готовят смешиванием 70 мл раствора ацетата натрия и 30 мл раствора уксусной кислоты. Доводят рН до нужного значения на рН-метре.

Приготовление растворов окрашенных субстратов. 250 мг порошкообразного окрашенного субстрата медленно прибавляют к 20 мл ацетатного буфера (0,1 М, рН 5,0) при перемешивании. Раствор нагревают до 70ºС и продолжают перемешивать в течение 15-30 мин., затем охлаждают до комнатной температуры и доводят объем до 25 мл. Раствор стабилен в течение 3-4 дней при хранении в холодильнике.

Осадитель для окрашенных субстратов. Растворяют 24,1 г безводного ацетата натрия и 4,8 г ацетата цинка в 150 мл дистиллированной воды. Доводят до рН 5,0 с помощью 5 М НСl, затем дистиллированной водой до 200 мл. Прибавляют 800 мл этанола и перемешивают. Приготовленный осадитель хранится в хорошо закрытой посуде при комнатной температуре.

Подготовка пробы. Образцы корма предварительно размалывают на лабораторной зерновой мельнице, после чего просеивают через сито с ячейками размером 150 мкм.

Готовят суспензию кормов 200 мг/мл в ацетатном буфере (рН 5,0, 0,1 М), после чего проводят экстракцию в этом буфере в течение 3 ч при температуре 40°С при перемешивании. Образцы центрифугируют 5 мин при 8000-10000 об/мин и отбирают супернатант (экстракт корма), который используют в дальнейшем для анализа.

Анализ. Гидролиз окрашенных субстратов проводят при температуре 40ºС в течение 1 ч. Реакционная смесь содержит 0,2 мл раствора окрашенного субстрата и 0,2 мл экстракта кормов.

Раствор окрашенного субстрата прогревают в течение 5 мин. до 40°С, затем прибавляют к нему предварительно прогретый до 40ºС экстракт корма и засекают время начала реакции. Через 1 ч после начала реакции к реакционной смеси прибавляют 1 мл осадителя, перемешивают и выдерживают 20-25 мин. при 20°С, после чего центрифугируют 5 мин. при 8000-13000 об/мин. Отбирают супернатант и проводят измерение его оптической плотности при λ490 относительно холостого опыта. В качестве холостого опыта используют систему, в которой вместо экстракта корма к раствору окрашенного субстрата добавлен ацетатный буфер.

Результаты. Была получена калибровочная зависимость для определения количества ферментного препарата в кормах. Для этого в модельную смесь кормов был добавлен сухой препарат целловиридин Г20Х в концентрации от 25 до 200 мкг/г (г/т). Зависимость между оптической плотностью при λ490 и концентрацией ферментного препарата АОЖТ-КМЦ и АОЖТ-ксилана (на примере целловиридина Г20Х) представлена на рисунке 1.

Рис. 1. Зависимость оптической плотности от концентрации ферментного препарата в корме

Полученные данные свидетельствуют о том, что с помощью окрашенных субстратов можно достоверно определять наличие в кормах добавок целловиридина в концентрации до 200 мкг/г (г/т). Следует отметить, что на практике целловиридин добавляют в концентрациях 50-100 мкг/г (г/т).

Определяли активность ферментных препаратов в образцах готовых комбикормов для бройлеров. Результаты представлены в таблице 2 (относительная ферментная активность выражена через относительную оптическую плотность). Корма № 1 и 4, не содержащие добавок ферментных препаратов, тем не менее дают определенный фон, обусловленный собственными ферментами зерна. Добавки ферментных препаратов в корма № 5-10 приводят к более активному расщеплению окрашенного полисахаридного субстрата и, как следствие к возрастанию оптической плотности при λ490.

Как видно, была достигнута высокая воспроизводимость результатов как в течение 1 дня, так и долговременная (на протяжении месяца) стабильность.

Из данных, приведенных в таблице 2, по калибровочным графикам были рассчитаны концентрации ферментных препаратов, содержащихся в анализируемых образцах кормов. Результаты анализа и данные, предоставленные производителем, приведены в таблице 3. В образце № 8 обнаружено заниженное значение концентрации ферментного препарата по сравнению с заявленными данными, в остальных образцах можно наблюдать достаточно хорошее соответствие паспортным данным.

Предложенный метод анализа может быть использован для оценки воздействия высоких температур (например, при гранулировании, экструдировании корма) на ферментные добавки, содержащиеся в кормах. Была изучена термостабильность ферментных препаратов. Для этого образцы сухого корма подвергали прокаливанию в сушильном шкафу при 105ºС в течение 1,5 ч. Оказалось, что остаточная активность целлюлаз, измеренная по АОЖТ-КМЦ, после прокаливания сохранилась на достаточно высоком уровне (рис. 2).

Таким образом, был разработан достаточно простой, чувствительный и воспроизводимый метод анализа целлюлазной и ксиланазной активностей ферментных препаратов с использованием окрашенных субстратов. Показана возможность применения метода для определения количества добавленных ферментных препаратов в корме, стабильности ферментов кормов при гранулировании, а также активности собственных ферментов зерна.

2. Результаты анализов (оптическая плотность при λ490), проведенных за 1 день и в течение месяца

Образцы	Оптическая плотность
Образцы	05.12	18.12	26.12	Среднее	Отклонение, %
Корм № 1	0,055	0,048	0,052	0,052	4,9
Корм № 4	0,050	0,049	0,044	0,048	4,8
Корм № 5	0,252	0,245	0,242	0,246	2,1
Корм № 7	0,301	0,289	0,284	0,291	4,0
Корм № 8	0,212	0,204	0,206	0,207	2,0
Корм № 10	0,339	0,337	0,328	0,335	1,8
В течение одного дня
Образцы	I	II	III	Среднее	Отклонение, %
Корм № 7	0,301	0,302	0,287	0,297	2,8
Корм № 10	0,332	0,341	0,335	0,336	1,4

3. Результаты анализа образцов и данные производителя

Образцы	Ферментный препарат	Введено (согласно данным производителя), мкг/г	Найдено, мкг/г
Корм № 5	Ровабио	50	48±1,2
Корм № 7	Ровабио	60	61±1,4
Корм № 8	Целловиридин Г20Х	70	56±1,0
Корм № 10	Целловиридин Г20Х	100	96±2,1

Рис. 2. Активность ферментов в кормах до и после сухого прокаливания