Термостабильность Ксибетенов

ВВЕДЕНИЕ

Общие закономерности стабильности энзимов в различных условиях изучены биохимиками довольно давно. Разрушение первичной и/или вторичной структур белковой молекулы обычно приводит к полной и необратимой инактивации фермента.  Стабильность фермента зависит от сохранности третичной (в некоторых случаях – четвертичной) структуры его белковой молекулы. Третичная структура белка  в растворе может изменяться в зависимости от температуры, рН среды и от присутствия (отсутствия) стабилизаторов и ингибиторов различной природы. Известно,  что термостабильность фермент-субстратного комплекса в растворе на несколько порядков выше, чем у фермента в отсутствии субстрата.  В очищенном кристаллическом виде энзимы имеют наибольшую стабильность. В сухих препаратах ферменты достаточно стабильны. Коммерческие сухие препараты могут храниться не менее года без снижения активности при соблюдении условий хранения, исключающих воздействие повышенной температуры, влажности, прямых солнечных лучей, химикатов  и т.п. При прочих равных условиях стабильность энзимов одного класса, но полученных из разных источников, определяется природой продуцента. О стабильности фермента обычно судят по результатам измерения активности фермента, то есть по измерению скорости химической реакции, катализируемой энзимом. Ферменты-карбогидразы катализируют сложные реакции гидролиза полимерных (часто нерастворимых) субстратов нерегулярного строения. Скорость таких реакций меняется не только в зависимости от начальных условий реакции, она изменяется во время реакции. Оценка стабильности коммерческого ферментного препарата в данном случае тесно связана с оценкой его эффективности и представляет собой непростую задачу.

Изучение стабильности отдельных энзимов и коммерческих ферментных препаратов продолжилось в связи с их повсеместным внедрением в производство кормов для животных. Yu и Tsen (1993) изучили стабильность некоторых карбогидраз в растворе и в кормосмеси и обнаружили, что целлюлаза теряет 20% своей активности при температуре 80°С в течении 5 минут только в растворе, а в кормосмеси потеря активности была незначительной; таким образом стабильность ферментов увеличивается при их смешивании с кормом. Viveros и др. (1994) проверили на бройлерах эффективность ячменного рациона, содержащего β-глюканазу, после автоклавирования в течении 10 минут при 70°С и при 90°С и обнаружили достоверный положительный результат по сравнению с рационами не содержащими ферментов. Это означает, что β-глюканазы выдерживают автоклавирование при этих температурах или то, что они успели разрушить β-глюкан как антипитательный фактор. Inborr и Betford (1994) изучали влияние времени и температуры выше 75°С на снижение β-глюканазной активности в кормовых добавках, содержащих коммерческие препараты. Они предположили, что частичная инактивация возникает в процессе гранулирования, и что положительное влияние добавки на продуктивность птицы отмечается только если температура гранулирования не превышает 85°С. Наконец, Almirall и Esteve-Garsia (1995) проинкубировали нативный препарат β-глюканазы из Trichoderma brachiatum в растворе при различных температурах и обнаружили что при 70°С активность снизилась до 65%, при 80°С – до 20%, а при 100°С раствор полностью инактивировался.

Для объективной оценки стабильности ферментного препарата большое значение играет не только выбор условий в которых проводятся эксперименты, но и выбор методики определения ферментативной активности. Большинство методов определения активности ферментов, гидролизующих некрахмалистые полисахариды, основаны на измерении концентрации восстанавливающих сахаров, образующихся при воздействии ферментов на чистые субстраты. После введения ферментов в комбикорм и распределения относительно небольшого количества новых активных препаратов в массе корма, после гранулирования комбикорма карбогидразы невозможно обнаружить в готовом корме методом прямого измерения ферментативной активности. Значительная концентрация собственных сахаров зерна не позволяет определять добавки низких концентраций ферментных препаратов из-за высокого фона контрольного опыта и, как следствие, высокой ошибки.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЙ

Изучить стабильность целлюлазы, ксиланазы и  β-глюканазы в процессе изготовле­ния микрогранулированных препаратов XYBETEN®.

Изучить  стабильность ксиланазного препарата Ксибетен-ксил с активностью 1000 ед/г и целлюлазного препарата Ксибетен-цел с активностью 15000 ед/г в процессе гранулирования кормов.

МЕТОДЫ  И  МАТЕРИАЛЫ

Термостабильность препаратов в лабораторных условиях. С использованием стандартных методик  по ФС-088 П-2003 проверяли исходную активность препаратов.  Образцы сухих препаратов выдерживали в сушильном шкафу при температуре 105°С в течение 0,5; 1,0; 1,5 часов, затем охлаждали в эксикаторе. Определяли остаточную активность целлюлазы, β-глюканазы и ксиланазы по ФС-088 П-2003.

Термостабильность препаратов в процессе микрогранулирования.  С использо­ванием стандартных методик по ФС-088 П-2003 определяли потери ферментативной активности в процессе отработки процесса микрогранулирования при различных условиях.

Термостабильность препаратов в составе комбикорма. Образцы рассыпного корма с ферментом и без ферментов до гранулирования, гранулированный корм с ферментом и без фермента получали с комбикормового завода «Марица - ООД». Норма ввода препаратов Ксибетен и Ксибетен-цел во всех случаях была 100 грамм на тонну. Состав корма приведен в таблице 1.

Таблица 1. Состав корма для бройлеров (по данным производителя)

Ингредиенты

Содержание  (%)

В ячменном рационе

В пшеничном рационе

стартер

Финиш

стартер

финиш

Ячмень

53,33

58,49

 

 

Пшеница

 

 

50,00

50,00

Кукуруза

 

 

7,84

11,01

Животный и растительный жир

3,00

3,00

3,00

3,00

Экструдат полножирной сои

28,09

34,07

10,78

16,58

Соевая мука (47,5% протеина)

11,53

1,07

24,23

16,06

DL-метионин

0,20

0,11

0,19

0,08

L-лизин HCl

0,01

 

0,1

0,04

L-треонин

 

0,03

 

 

Карбонат кальция

1,18

1,31

1,20

1,30

Дикальцийфосфат

1,81

1,21

1,83

1,24

Соль

0,45

0,32

0,44

0,30

Минерально-витаминный премикс

0,40

0,40

0,40

0,40

Расчетное содержание питательных веществ

Обменная энергия, ккал/кг

3,050

3,150

3,050

3,150

Сырой протеин

21,7

19,7

21,8

20,3

Лизин

1,20

1,05

1,20

1,05

Метионин + цистин

0,92

0,77

0,90

0,76

Кальций

1,00

0,90

1,00

1,00

Неорганические фосфаты

0,45

0,35

0,45

0,35

Термостабильность препаратов в рассыпном корме проверяли в лабораторных условиях. Образцы сухих препаратов выдерживали в сушильном шкафу при температуре 105°С в течение 0,5; 1,0; 1,5 часов, затем охлаждали в эксикаторе.

Гранулирование осуществлялось в промышленных условиях на грануляторе модели 20НР с использованием пара. Температура в процессе гранулирования измерялась в кондиционере, на выходе пресса и в охладителе. В таблице 2 приводятся температуры в процессе гранулирования корма с ферментом и без фермента.

Таблица 2. Температура корма в процессе гранулирования, °С

№

Тип корма

Температура на выходе

кондиционера

гранулятора

охладителя

Пшеничный рацион

1

Стартерный корм без фермента

63-65

68-79

39-58

2

Стартерный корм с ферментом

63-66

74-81

34-57

3

Финишный корм без фермента

64-65

57-72

25-47

4

Финишный корм с ферментом

63-65

69-77

35-59

Ячменный рацион

5

Стартерный корм без фермента

63-66

69-77

36-59

6

Стартерный корм с ферментом

63-66

69-75

35-53

7

Финишный корм без фермента

63-67

58-69

25-44

8

Финишный корм с ферментом

61-66

60-73

27-55

Метод оценки активности ксиланаз и целлюлаз в кормах.

Исходную и остаточную активность ксиланазы и целлюлазы в комбикорме оценивали в относительных единицах оптической плотности по методу взаимодействия с окрашенным субстратом.

Метод основан на измерении интенсивности образования окраски при гидролизе синтетических окрашенных полисахаридных субстратов (окрашенной целлюлозы или окрашенного ксилана) под действием собственных ферментов зерна или специально добавленных ферментов - целлюлаз или ксиланаз.

Необходимые приборы и материалы:

Реагенты:

Приготовление рабочих растворов.

а) Ацетатный буфер. 11,5 мл ледяной уксусной кислоты растворяют в 1500 мл дистиллированной воды, перемешивают и доводят объем до 2000 мл; 16,4 г безводного ацетата натрия растворяют в 1500 мл дистиллированной воды, перемешивают и доводят объем до 2000мл; буферный раствор (рН 5,0) готовят смешиванием 70 мл раствора ацетата натрия и 30 мл раствора уксусной кислоты. Доводят рН до нужного значения на рН-метре.

б) Раствор окрашенных субстратов. 250 мг порошкообразного окрашенного субстрата медленно прибавляют к 20 мл ацетатного буфера (0,1 М, рН 5,0) при перемешивании. Раствор нагревают до 70ºС и продолжают перемешивать в течение 15-30 мин., затем охлаждают до комнатной температуры и доводят объем до 25 мл. Раствор стабилен в течение 3-4 дней при хранении в холодильнике.

в) Осадитель для окрашенных субстратов. Растворяют 24,1 г безводного ацетата натрия и 4,8 г ацетата цинка в 150 мл дистиллированной воды. Доводят до рН 5,0 с помощью 5 М НСl, затем дистиллированной водой до 200 мл. Прибавляют 800 мл этанола и перемешивают. Приготовленный осадитель хранят в хорошо закрытой посуде при комнатной температуре в течение 1 месяца.

Подготовка пробы.

Образцы корма предварительно размалывают на лабораторной зерновой мельнице, после чего просеивают через сито с ячейками размером 150 мкм.

Готовят суспензию кормов 200 мг/мл в ацетатном буфере (рН 5,0, 0,1 М), после чего проводят экстракцию в этом буфере в течение 3 ч при температуре 40°С при перемешивании. Образцы центрифугируют 5 мин при 8000-10000 об/мин и отбирают супернатант (экстракт корма), который используют в дальнейшем для анализа.

Анализ.

Гидролиз окрашенных субстратов проводят при температуре 40ºС в течение 1 ч. Реакционная смесь содержит 0,2 мл раствора окрашенного субстрата и 0,2 мл экстракта кормов.

Раствор окрашенного субстрата прогревают в течение 5 мин. до 40°С, затем прибавляют к нему предварительно прогретый до 40ºС экстракт корма и отмечают время начала реакции. Через 1 ч после начала реакции к реакционной смеси прибавляют 1 мл осадителя, перемешивают и выдерживают 20-25 мин. при 20°С, после чего центрифугируют 5 мин. при 8000-13000 об/мин. Отбирают супернатант и проводят измерение его оптической плотности при 490 нм относительно фона. В качестве фона используют систему, в которой вместо экстракта корма к раствору окрашенного субстрата добавлен ацетатный буфер.

Построение калибровочного графика.

В модельную смесь кормов (60% пшеницы и 40% соевой муки - для препарата Ксибетен-ксил или 60% ячменя и 40% соевой муки - для препарата Ксибетен-цел) добавляли сухой микрогранулированный препарат в дозировке от 25 до 200 мкг/г (г/т). Смесь размалывают на лабораторной зерновой мельнице, после чего просеивают через сито с ячейками размером 150 мкм.

20 грамм размолотой смеси суспендируют в 100 мл  ацетатного буфера (рН 5,0, 0,1 М), после чего проводят экстракцию в этом буфере в течение 3 ч при температуре 40°С при перемешивании. Образцы центрифугируют 5 мин при 8000-10000 об/мин и отбирают супернатант (экстракт модельного корма), который используют в дальнейшем для построения калибровки.

Зависимость между оптической плотностью при 490 нм и концентрацией ферментного препарата определяли после воздействия целлюлазы препарата Ксибетен-цел на окрашенный субстрат карбоксиметилцеллюлозы (АОЖТ-КМЦ) и после воздействия ксиланазы препарата Ксибетен на окрашенный субстрат арабиноксилана (АОЖТ-ксилан).  На рисунке 1 представлены калибровочные зависимости для оценки «количества» ферментного препарата Ксибетен-цел и Ксибетен в кормах.

Рис. 1. Зависимость оптической плотности от количества ферментного препарата, введенного  в корм (модельная смесь)

 

РЕЗУЛЬТАТЫ   ИССЛЕДОВАНИЯ   СТАБИЛЬНОСТИ   ПРЕПАРАТОВ

Микрогранулирование препаратов XYBETEN®  проводили на установке марки Glatt-fluid bed drier  при температуре 60 и 80oC.

В таблице 3 приведены потери активности целлюлазы, ксиланазы и бета-глюканазы в процессе микрогранулирования в зависимости от времени и температуры.

Таблица 3. Потери активности в процессе микрогранулирования

Образец

Ксибетен-ксил

Ксибетен-цел

ксиланаза

Целлюлаза

β-глюканаза

целлюлаза

ед/г

%

ед/г

%

ед/г

%

ед/г

%

Температура гранулирования 60о

Начало

1150

100

6900

100

4100

100

15000

100

Через 0,5 часа

1130

98

6830

99

3940

96

14700

98

Через 1,0 час

1115

97

6760

98

3770

92

14550

97

Через 1,5 часа

1090

95

6690

97

3650

89

14400

96

Температура гранулирования 80о

Начало

1150

100

6900

100

4100

100

15000

100

Через 0,5 часа

1100

96

6690

97

3772

92

14400

96

через 1,0 час

1050

91

6420

93

3530

86

13520

90

через 1,5 часа

1000

87

6140

89

3200

78

12750

85

В таблице 4 приведены результаты сухого прокаливания порошковых  субстанций и микрогранулированных препаратов при температуре 105ºС. Из результатов видно, что в сухом виде термостабильность микрогранулированных препаратов выше, чем порошкообразных. Это можно объяснить стабилизирующим влиянием натрий-карбоксиметилцеллюлозы. 

Таблица 4. Остаточная активность препаратов после сухого прокаливания

Образец

Ксибетен-ксил

Ксибетен-цел

ксиланаза

Целлюлаза

β-глюканаза

целлюлаза

ед/г

%

ед/г

%

ед/г

%

ед/г

%

Порошок

до прогрева

2400

100

16000

100

9200

100

32150

100

через 0,5 часа

2210

92

15355

96

8740

95

30540

95

через 1,0 час

1610

67

14250

89

8280

90

27970

87

через 1,5 часа

1030

43

8650

54

4420

48

17680

55

Микрогранулы

до прогрева

1000

100

6100

100

3570

100

15000

100

через 0,5 часа

950

95

5980

98

3460

97

14550

97

через 1,0 час

900

90

5800

95

3355

94

14250

95

через 1,5 часа

760

76

4400

72

2500

70

10500

70

Для исследования стабильности препаратов XYBETEN® в негранулированных кормах отбирали образцы кормосмеси на выходе из кондиционера (перед поступлением смеси в гранулятор). Образцы корма прокаливали в сушильном шкафу при температуре 105ºС. Исходную и остаточную активность оценивали по методу окрашенных субстратов. По относительным единицам оптической плотности раствора красителя, образовавшегося под действием энзимов, расчитывали условное «содержание» ферментного препарата в тонне корма. В результате исследований не обнаружено достоверных различий по стабильности ферментов в стартерных и финишных кормах. Следует отметить, что корма не содержащие ферментных препаратов, в опыте с окрашенными субстратами дают небольшой фон, который не наблюдался при построении калибровочного графика. Возможно этот фон обусловлен активизацией собственных ферментов зерна в процессе кондиционирования корма. На диаграмме (рисунок 2) представлены усредненные результаты исследований всех видов негранулированных кормов.

В таблице 5 представлены данные по остаточному «содержанию» ферментных препаратов в гранулированных кормах. Из данных таблицы следует, что потери ферментативной активности при температуре грануляции 80ºС не превышают 2%. Эта величина находится в пределах погрешности методики косвенного определения ферментов в комбикорме.

По температуре, времени воздействия и влажности материала процессы микрогранулирования чистого препарата и гранулирования комбикорма с ферментом подобны. При микрогранулировании в отсутствии стабилизирующего действия зерновых субстратов потери ферментов при 80ºС выше и составляют 5-10% по данным прямого измерения активности препарата, а при 90ºС увеличиваются до 10-20%.

Таблица 5. «Содержание» препаратов XYBETEN® в гранулированных кормах

№

Тип корма

Средняя температура гранулирования, °С

Добавлено препарата, г/т

«Найдено» после гранулирования, г/т

Пшеничный рацион

1

Стартерный корм без фермента

Стартерный корм с ферментом

Финишный корм без фермента

Финишный корм с ферментом

78

0

1

2

80

100

99

3

65

0

2

4

75

100

100

Ячменный рацион

5

Стартерный корм без фермента

Стартерный корм с ферментом

Финишный корм без фермента

Финишный корм с ферментом

78

0

1

6

74

100

101

7

67

0

2

8

68

100

101

Рис. 2. «Содержание» ферментных препаратов в негранулированных  кормах до и после сухого прокаливания при температуре 105°С.

На диаграмме (рисунок 3) приведены результаты определения остаточного «количества» препаратов в составе гранулированных комбикормов после их сухого прокаливания. Как видно из результатов в гранулированных кормах обеспечивается  хорошая стабильность ферментов XYBETEN®.

Рис. 3. «Содержание» ферментных препаратов в гранулированных  кормах до и после сухого прокаливания при температуре 105°С.

ВЫВОДЫ

На основе полученных данных можно сделать следующие выводы.

  1. Термостабильность ферментных препаратов XYBETEN®, полученных на основе культивирования штамма Trichoderma longibrachiatum TW-1, соответствует уровню термостабильности ферментов, свойственному роду Trichoderma.
  2. Микрогранулирование повышает термостабильность препаратов и делает их стабильными при температуре гранулирования комбикорма 80ºС.
  3. При температуре гранулирования 85-90ºС рекомендуется увеличивать дозировку сухого препарата на 10-15% или применять жидкие формы препаратов XYBETEN® после гранулирования.
  4. Рекомендуется использовать жидкие формы препарата XYBETEN® для обработки корма после экструдирования или экспандирования.

 

ЛИТЕРАТУРА

  1. Almirall, M., and E. Esteve-Garcia, 1995. In vitro stability of a β-glucanase preparation from Trichoderma brachiatum and its effect in a barley based diet fed to broiler chicks. Anim. Feed Sci. Technol. 54:149-158.
  2. Inborr, J., and M. R. Bedford, 1994. Stability of enzymes to steam pelleting during feed processing. Anim. Feed Sci. Technol. 46:179-196.
  3. Viveros, A., A. Brenes, M. Pizarro, and M. Castaño, 1994. Effect of enzyme supplementation of a diet based on barley, and autoclave treatment, on apparent digestibility, growth performance and gut morphology of broilers. Anim. Feed Sci. Technol. 48:237-251.
  4. Yu, B., and H. Y. Tsen, 1993. An in vitro assessment of several enzymes for the supplementation of rabbit diets. Anim. Feed Sci. Technol. 40:309-320.

Наверх