Экзогенные ферменты. Бедфорд

 

Экзогенные ферменты

В кормлении моногастричных животных:

настоящее и будущее

 

Майкл Р. Бедфорд, Великобритания

Animal Feed Science and Technology, 2000, v. 86, pp. 1-13.

 

Резюме

Экзогенные (кормовые) ферменты, в частности, рассматриваемые в данной статье карбогидразы и фитаза, сейчас интенсивно используются по всему миру как добавки в рационы для нежвачных животных. Химическое действие этих ферментов хорошо изучено, однако конкретные причины их полезного действия в рационах для животных все еще являются предметом для дискуссий. Тем не менее, известно, что общий результат введения этих ферментов в рационы заключается в том, что они снижают разницу в кормовой ценности плохих и хороших образцов данного кормового компонента. В результате лучше удовлетворяются потребности животных в данном компоненте, причем на рационах с более низкой концентрацией целевого компонента. Также снижается и разброс по продуктивности между различными стадами, возникающий вследствие разброса по составу рационов. С другой стороны, фитаза, например, ранее использовалась с одной основной целью - повысить доступность фитатного фосфора из растительных источников, что снижает вывод фосфора из организма животного и позволяет сократить дачу животным неорганического фосфора. Недавно были описаны и другие полезные аспекты использования фитазы на эффективность использования энергии и доступность аминокислот, позволяющие и далее повышать эффективность использования кормовых ресурсов. Последние исследования по кормовым ферментам затрагивают вопрос о вариабельности ответа на их введение. Вариабельность субстрата и факторы взаимодействия внутри ферментных систем значительно влияют на ответ организма животных на введение экзогенных ферментов. В настоящее время разработаны методики, позволяющие учесть такие факторы и определять оптимальные дозы введения ферментов-карбогидраз для пшеницы и ячменя. Проводятся соответствующие исследования и для рационов на основе кукурузы, а также по оптимизации использования фитазы. Дальнейшие исследования в этой области позволят более эффективно использовать уже известные ферменты и эффективно искать новые. Разработка новых термотолерантных ферментов также даст новые возможности для их использования в рационах, где ранее они не применялись.

1. Введение

Использование ферментов в рационах для птицы в Европе стало практически повсеместным. Причин тому много, и в том числе следующие.

• Повышение кормовой ценности кормокомпонентов. Многие авторы подчеркивают повышение продуктивности при использовании экзогенных ферментов в рационах на ячмене (Classen et al., 1985; Elwinger and Saterby, 1987; Broz and Frigg, 1990; Brenes et al., 1993; Marguard et al.,1994), пшенице (Classen et al., 1995; Bedford and Morgan, 1996; Hughes and Zviedrans, 1999), а в последнее время - и кукурузы (Wyatt et al., 1997а, 1999; Steenfeldt et al., 1998). Фитазы обычно используют, прежде всего, в регионах с неблагоприятными климатическими условиями вследствие их способности повышать доступность фосфора из растительных источников (Simons et al., 1990; Jongbloed et al., 1997; Kornegay et al., 1997; Kemme et al., 1999). Из этих исследований следуют два основных вывода. Во-первых, данный целевой компонент можно использовать более широко, в больших количествах, чем раньше, и, во-вторых, снижается себестоимость производства кормов вследствие снижения содержания в них ценных, но дорогих компонентов, таких как жир и рыбная мука.

• Снижение разброса по кормовой ценности компонентов. Ответ на введение ферментов более резко выражается на низкокачественных компонентах (Classen et al., 1995; Scott et al., 1995, 1998а; Bedford et al., 1998). В результате также снижается и вариабельность продуктивности птицы, стадо делается более однородным, снижается также разброс продуктивности между различными стадами. Это представляет весьма значительную выгоду и для птицеводов, снижая потери при выращивании птицы, и для производителей кормов, которым нужно поддерживать заданные параметры кормовой ценности рационов.

• Снижение влажности помета. Дача рационов с высоким содержанием ячменя, ржи, овса, тритикале и, в меньшей степени, пшеницы часто приводит к тому, что помет птицы становится вязким и влажным (Classen et al., 1985;  Elwinger  and Teglof, 1991; Newman et al., 1992; Carre et al., 1994; Bedford and Morgan, 1996).

Разумеется, что вышеизложенные выгоды встречают понимание со стороны птицеводов и производителей кормов. В данной статье принято разделение используемых в настоящее время ферментов на три основных категории:

1. для вязких зерновых, например пшеницы, овса, тритикале и ячменя;

2. для невязких зерновых, например кукурузы и сорго;

З. фитаза.

Первые две группы - это, прежде всего, продукты на основе карбогидраз, и их мы будем рассматривать отдельно от фитазы.

2. Карбогидразы

1. Ферменты для вязких зерновых. Из ферментов, расщепляющих некрахмальные полисахариды (НКП), последние привлекают к себе более всего внимания. В цели данной работы не входит детальное обсуждение механизмов их действия, мы можем лишь порекомендовать читателю обратиться к подробным работам на эту тему (Campbell and Bedford, 1992; Jeroch et al., 1995; Siman, 1998). В двух словах, вязкие зерновые вызывают повышения вязкости химуса, что реально снижает уровни переваримости. Физическая структура стенок клеток эндосперма таких зерновых может также препятствовать доступу пищеварительных ферментов к содержимому этих клеток. Дача соответствующих ферментов снижает последствия этих затруднений и делает пищеварение более быстрым и более эффективным.

2. Ферменты для невязких зерновых. Вариабельность кормовой ценности различных образцов кукурузы, как было не так давно показано, не уступает таковой у ячменя и пшеницы (Leeson et al., 1993; Collins et al., 1998). Ферменты могут снижать этот разброс и повышать уровень переваримости рационов на основе кукурузы и сорго (Wyatt et al., 1997а,b, 1999; Pack et al., 1998а). Точный механизм их действия в данном случае нуждается в дальнейших исследованиях, хотя несколько возможных схем уже предложены.

Говоря в целом об обеих группах злаков, независимо от механизма действия, использование ферментов приводит к повышению переваримости питательных веществ. Это важно, поскольку это смещает место переваривания и всасывания крахмала и протеина выше по желудочно - кишечному тракту, в место, где выше плотность населяющей его микрофлоры и интенсивнее конкуренция за субстрат. Это явление усиливается с возрастом птицы, по мере созревания желудочно-кишечного тракта и роста популяции микрофлоры; особенное значение оно приобретает в отсутствие дачи антибиотиков. На Рис. 1 показана схема обсуждаемого процесса.

При прохождении кормовой массы через мускулистый и железистый желудки она практически полностью стерилизуется из-за перепадов рН и активности пепсина. Кроме того, когда она входит в 12-перстную кишку, она подвергается быстрому и значительному изменению рН в сторону нейтральности, что также подавляет жизнедеятельность желудочных бактерий, попавших в кишечник вместе с химусом. Мощный приток пищеварительных ферментов, желчных кислот, лецитина и лизоцима добивает уцелевшие бактерии, поэтому в 12-перстной кишке бактерии практически отсутствуют. В верхних отделах пищеварительного тракта эффективность переваривания обусловлена, прежде всего, высокой концентрацией панкреатических ферментов и активностью энтероцитов (Uni et al., 1999). При прохождении химуса через тонкий кишечник концентрации пищеварительных ферментов и желчных кислот неуклонно снижаются, так как они либо катаболизируются, либо всасываются (Campbell et al., 1983; Schneeman and Gallaher, 1985; Noy and Sklan, 1994; Raul and Schleiffer, 1996; Taranto et al., 1997). В результате среда тонкого кишечника становится все более гостеприимной для колонизации бактериями.

Если рацион был легкопереваримым, то большинство питательных веществ перевариваются и всасываются до того, как химус попадает в отделы пищеварительного тракта, где бактерии процветают. В результате популяции бактерий задней части тонкого кишечника сводятся к минимуму, главным образом, из-за ограниченного количества субстрата. Однако при труднопереваримых рационах питательные вещества не поддаются перевариванию и всасыванию и доходят примерно до середины тонкого кишечника, где населяющие этот участок пищеварительного тракта бактерии вполне в состоянии воспользоваться таким субстратом и успешно размножаться, как показано при сравнении рационов на основе ржи (труднопереваримого) и кукурузы (легкопереваримого) в исследовании Wagner and Thomas, 1987. Говоря о стимуляции бактериального роста, можно выделить несколько видов бактерий, способных колонизировать более верхние участки тонкого кишечника, поскольку они способны выделять ферменты, активно расщепляющие вещества с антимикробной активностью, выделяемые самим организмом птицы, например желчные кислоты (Christl et al., 1997; Tarano et al., 1997). В результате деконъюгации и дегидроксилирования эти вещества теряют свое антимикробное действие, и чувствительные к ним бактерии способны колонизировать более высокие участки тонкого кишечника. Удаление этих активных веществ также приводит к ухудшению всасывания жира, поскольку желчные кислоты важны для эффективного образования мицелл (Campbell et al., 1983).

Очевидно, что последствия чрезмерного размножения бактерий будут самыми разнообразными, достаточно принять во внимание, что для разросшейся популяции понадобится все больше энергии и протеина из рациона, то есть бактерии отнимут их у организма «хозяина».

Следовательно, последствия снижения переваримости рациона следует рассматривать с двух точек зрения, чтобы адекватно оценить выгоды от использования ферментов для зерновых. Первая касается прямого влияния труднопереваримого рациона на уровни ассимиляции питательных веществ организмом птицы. Вторая рассматривает разнообразные последствия увеличения притока субстрата для микробных популяций, населяющих тонкий кишечник и слепые кишки. Первый момент, безусловно, ограничивает скорость роста птицы, а второй может привести к снижению эффективности использования переваренных и/или абсорбированных питательных веществ из-за конкуренции за субстрат и, в результате, сказаться на состоянии здоровья птицы.

Было доказано, что ферменты повышают переваримость труднопереваримых злаков, отчего их кормовая ценность даже превышает ценность легкопереваримых злаков (Classen et al., 1995; Scott et al., 1998а,b). Для производителей кормов такое действие ферментов имеет два важных последствия:

1. снижается различие между хорошими и плохими партиями данного злака;

2. на практике среднее содержание питательных веществ в злаках при добавлении ферментов выше, чем без добавления, в результате чего питательность рациона повышается.

На Рис. 2 графически показаны эти выгодные моменты. Таким образом, ответ на введение фермента заключается в улучшении извлечения питательных веществ в тонком кишечнике благодаря улучшению переваримости и в снижении микробной активности в результате ограничения количества субстрата в подвздошной кишке (Рис. 3). Оба эти следствия явно полезны для продуктивности птицы, однако недавно выяснилось, что, возможно, существует и третий механизм, который также нельзя сбрасывать со счетов, а именно активное питание ряда видов бактерий. Здесь мы не будем входить в детали, лишь порекомендуем читателю обратиться к более подробным источникам (Apajalahti et al., 1995; Apajalahti and Bedford, 1999). Отметим лишь, что в результате действия ферментов на вязкие биополимеры и углеводы клеточных стенок образуются сахара и их олигомеры, используемые, прежде всего, определенными видами бактерий подвздошной и слепой кишок. В результате они размножаются, подавляя другие, возможно, вредные виды бактерий и, таким образом, положительно влияют на рост и здоровье птицы (Apajalahti and Bedford, 1999).

Здесь представляется необходимым подчеркнуть, что последствия дачи птице труднопереваримых рационов и, следовательно, выгода от добавления к таким рационам ферментов, более очевидны у обычных цыплят по сравнению с гнотобиологическими, т.е. выращенными в стерильных условиях и лишенными микрофлоры (Langhout 1998; Schutte and Langhout, 1999). Поскольку микрофлора возрастает в числе с ростом птицы практически с нуля при вылуплении до полного заселения примерно в З недели жизни, вероятно, что положительное влияние ферментов осуществляется опосредованно, при участии микробиологического комплекса более взрослой птицы, тогда как у более молодой птицы с плохо развитой пищеварительной системой (Kijavainen and GibsonКi ана ОiЬзоп, 1999) это влияние проявляется, скорее всего, более непосредственно. Предполагается, что до достижения птицей возраста 8 дней выход панкреатических ферментов может сильно ограничивать переваривание (Lindemann et al., 1986; Krogdahl and Sell, 1989; Nitsan et al., 1991; Dunnington and Siegel, 1995). Добавление соответствующего экзогенного фермента, следовательно, просто улучшает переваривающую функцию молодого пищеварительного тракта, и, опять-таки, положительный ответ на введение ферментов более четко проявляется на труднопереваримых рационах по сравнению с легкопереваримыми. Возможно, что с ростом птицы, т.е. с развитием пищеварительного тракта и ростом популяции микрофлоры, эффект от введения ферментов проявляется все более опосредованно, через эту популяцию.

Химическая природа вязких углеводов, структур клеточных стенок и непереваримых крахмально - протеиновых комплексов, которые являются субстратом для рассматриваемых нами здесь ферментов, крайне разнородна. Поэтому и применяемые ферменты сильно различаются по целевым субстратам, причем молекулярная масса субстратов может различаться на несколько порядков; огромны различия и по структуре и химической природе сахаров-заместителей в побочных цепях субстратов. В результате положительный эффект может наблюдаться при использовании любого одного фермента из рассматриваемого спектра, причем эти ферменты могут получаться от совершенно различных организмов-источников и обладать совершенно различными механизмами действия. Как будет показано ниже, это открывает широкие возможности для улучшения эффективности по мере углубления нашего понимания химической природы основных антипитательных веществ.

3. Фитаза

Недавно опубликован целый ряд обзоров и статей, посвященных использованию фитазы в кормах для животных. Фитат (Рис. 4), целевой субстрат этого фермента, в отличие от углеводов, речь о которых шла выше, является конкретным химическим веществом. Предполагают, что он является «хранилищем» фосфатов в растениях; известно также, что он обладает значительным антипитательным действием в организмах животных. Фитат сам по себе не является таким уж хорошим источником фосфора для нежвачных, особенно для молодняка, поскольку они, чаще всего, не в состоянии эффективно использовать это соединение, несмотря на наличие эндогенных фитаз, выделенных, например, из тонкого кишечника бройлеров и кур-несушек (Maenz et al., 1997; Maenz and Classen, 1998). Следовательно, в отсутствие добавок неорганического фосфора в рационы для большинства нежвачных животных высок риск возникновения дефицита фосфора. Вследствие неопределенности с доступностью фосфора из растительных источников, при составлении рационов обычно пользуются неорганическими фосфатами для удовлетворения основных потребностей животных в этом элементе. Поэтому большинство рационов для нежвачных содержат намного больше фосфора, чем нужно животному. Этот избыток просто выводится из организма с пометом. Желание снизить выброс фосфора в окружающую среду по настоянию экологов в некоторых частях Европы, а недавно и в США, создало условия для применения экзогенных фитаз. Применение этого фермента позволяет животному получить доступ к большей части съедаемого им растительного фосфора, что позволяет снизить количества неорганических фосфатов в кормах. В результате выброс фосфора в окружающую среду значительно снижается.

Однако активность фитазы не обладает стопроцентной предсказуемостью. Известно, что ее положительное действие обусловлено рядом факторов, включая род кормового сырья, источник фитазы, возраст животного, содержание в рационе кальция, фосфор и витамина D, уровень активности фитазы в каждом из использованных компонентов корма. Каждый из этих факторов будет более подробно обсуждаться ниже.

Содержание фитата в различных ингредиентах корма сильно различается, как показано в Табл. 1; доступность фитата для гидролиза экзогенной фитазой отличается от ингредиента к ингредиенту (Ravindran et al., 1999). Практическое следствие такого разброса - значительные коэффициенты запаса при оценке количества фосфора, освобождающегося при гидролизе фитата. Следует помнить, что последствия переоценки эффективности гидролиза фитата могут быть плачевными. Завышенная предварительная оценка количества фосфора, ставшего доступным вследствие применения фитазы, в производственных условиях может привести к заметному снижению выгоды от ее использования (van Tuijl, 1998). Тем не менее, выгоды в отношении снижения выделения фосфора в среду и затрат на корма остаются очевидными, и поэтому на настоящий момент фитаза является общепризнанной кормовой добавкой.

Использование фитазы экономически эффективно, прежде всего, потому, что можно отказаться от неорганического фосфора в кормах. Достаточно вспомнить, что количество фитазы, заменяющее 10 г неорганического фосфата, колеблется от < 400 ед/кг для бройлеров в возрасте 21-42 дня до примерно 1000 ед/кг для бройлеров в возрасте 0-21 день (Kornegay et al., 1996; Kornegay et al., 1997). Такой разброс, помимо чисто научного интереса, также приводит к тому, что приходится использовать более высокие значения коэффициентов запаса, чем это обычно принято. Причины этого разброса, возможно, связаны с различиями в скорости прохождения корма, которая склонна увеличиваться с возрастом птицы (Washburn, 1991; Almirall and Garcia, 1994), что, по-видимому, дает более широкие возможности для активности фитазы и позволяет также более широко использовать культуры, рН которых более приспособлен для промышленных препаратов фитазы из грибков рода Aspergillus (Zyla, 1992; Radcliff et al., 1998).

Чем выше содержание кальция в рационе, тем хуже эффективность деятельности фитазы (Fisher, 1 992; Lei et al., 1994; Sebastian et al., 1996). Кальций, как полагают, не только осаждает фитат, но также и взаимодействует с растворимым субстратом, таким образом, снижая доступность субстрата для ферментной атаки (Sebastian et al., 1996). Использование хелатов, таких как цитрат, удаляющих кальций из растворимых фитатных комплексов, эффективно повышает проявление активности фитазы (Zyla  et al., 1996; Boling et al., 1998; Maenz et al., 1999; Qian et al., 1999). Снижение уровня кальция в рационе также положительно сказывается на стоимости кормов. Важно не только абсолютное содержание кальция, но и отношение кальций/фосфор в рационе, причем чем больше это отношение, тем хуже проявляется действие фитазы (Qian et al., 1997). С уровнями кальция и фосфора в рационе также связано содержание в нем витамина D. Повышение последнего при одновременном снижении уровня кальция повышает уровень утилизации фитата даже в отсутствие добавок фитазы (Edwards, 1992; Fisher, 1992).

Вариабельность ответа на добавление фитазы и различия в переваримости фосфора между компонентами корма возникают если не вследствие, то, по крайней мере, при участии активности фитазы, содержащейся в тех или иных количествах в этих компонентах. Например, активность фитазы была обнаружена в пшенице, причем она заметно различалась в разных образцах пшеницы. Переваримость фосфора из образцов с более высокой собственной активностью фитазы, как было показано, почти на 50% выше, чем из образцов с более низкой активностью эндогенной фитазы (Barrier-Guillot et al., 1996а,b) (Рис. 5). Следовательно, можно ожидать, что добавление фитазы к таким образцам даст меньший положительный эффект. Выгода от использования экзогенной фитазы заключается в снижении разброса по удержанию фосфора между разными образцами зерновых.

Фитат сам по себе часто существует в виде протеин-фитатного комплекса, а находясь в тонком кишечнике в свободном состоянии, как полагают, связывается с протеинами и делает их менее доступными для протеолиза и связывания с пищеварительными ферментами, т.е. снижают эффективность их утилизации (Liebert et al., 1996; Sebastian et al., 1998). В результате некоторые авторы отметили положительное действие фитазы, хотя и в различной степени, на переваримость аминокислот в рационах птицы (Martin et al., 1998;  Namkung and Leeson, 1999; Ravindran et al., 1999). Степень ответа переваримости аминокислот на добавление фитазы в высокой степени зависит от того, какие использовались кормокомпоненты. Однако хотя этот ответ был отмечен на дефицитном по аминокислотам рационе на основе соевого шрота, на рационе на основе арахисового шрота такого ответа замечено не было (Biehl and Baker, 1997). Как следствие, всегда бывает трудно предсказать степень улучшения утилизации аминокислот из рациона при использовании фитазы, если компоненты рациона заметно меняются.

Вариации ответа на введение фитазы между компонентами корма могут также быть связаны с тем, в каких частях растения находятся основные запасы фитата. В кукурузе он сконцентрирован в зародыше (дерме), тогда как в пшенице он находится в алейроновом слое. В соевых бобах фитат связан с протеиновыми гранулами, а в арахисе находится в кристаллоидах. Такие «географические» различия могут заметно влиять на подверженность природного фитата гидролизу под действием экзогенной фитазы, чем и может объясняться вариабельность результатов, полученных в разных исследованиях.

 

4. Перспективы на будущее

Очевидно, что за последние 10 лет произошел резкий прорыв в области использования и ферментов, предназначенных для обеих групп злаков, и фитазы. Тем не менее, можно выделить три области, где еще можно добиться реального прогресса:

1. Идентификация субстратов. Интересующие нас субстраты пока довольно плохо идентифицированы. Даже в случае фитата, где известна его химическая природа, связи этой молекулы с другими в общепринятых компонентах кормов пока еще не вполне ясны. Более точное понимание состояния субстрата в кормокомпонентах позволит разработать соответствующие ферментные комплексы, где несколько ферментов будут сообща разлагать целевой субстрат. Использование ферментов, разрушающих клеточные стенки, в комплексе с фитазой, например, позволит быстрее делать фитат доступным для гидролиза, что, без сомнения, улучшит вышеописанное положительное действие этих ферментов на животных. Подобный «симбиоз» был уже продемонстрирован на примере комбинации ксиланаз и фитазы на бройлерах (Ravindran et al., 2000). Анализ самих целевых кормокомпонентов, с одной стороны, и их поведения в смеси с другими в составе корма, с другой, позволили оптимизировать дозы введения ферментов для рационов на основе пшеницы и ячменя (Pack and Bedford, 1998b), однако для рационов на основе кукурузы и для фитазы такие исследования пока не проведены.

2. Характеристики используемых ферментов.  Использующиеся в настоящее время ферменты не в состоянии выдерживать самые агрессивные из существующих сейчас процедур переработки материалов для кормов, такие как экспандирование или гранулирование при температурах свыше 95ºС. Это обстоятельство заставляет вносить ферменты в корм в жидком виде уже после гранулирования. Среди возможных трудностей - не только эта, требующая использования дорогого оборудования, возможны и другие, например, нехватка необходимых производственных площадей на существующих сейчас предприятиях по производству кормов. Исследования, направленные на поиск более термоустойчивых ферментов, позволят использовать сухие порошкообразные ферменты для приготовления кормов с использованием высокотемпературной обработки компонентов, и дополнительное оборудование для жидкофазного внесения ферментов в корма не понадобится.

З. Конечные продукты действия ферментов. По-видимому, конечные продукты деятельности ферментов не менее важны, чем сам по себе гидролиз целевого субстрата. Лучшее понимание роли, которую играют олигомерные сахара в поддержании, например, предпочтительного состава микрофлоры, приведет к разработке более качественных продуктов в производстве кормов. Это особенно важно теперь, когда большинство профилактических антибиотиков в Европе исключено из состава кормов. Именно вследствие этого важно поддерживать условия для роста и развития нужных бактерий и для подавления роста патогенов и других бактерий, снижающих продуктивность животных. Связь кормления и микробиологии желудочно-кишечного тракта становится все более интересным объектом для исследований.